химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

ре его расположен остаток гистидина (H1s231), по-видимому, играющий важную роль в катализе. Этот остаток своим NC1-атомом связан с карбоксильной группой остатка Asp226, что в известной степени напоминает ситуацию у сериновых протеаз.

Как и в карбоксипептидазе, в активном центре термолизина расположена боковая цепь остатка аргинина (Arg203).

Дипептидилкарбоксипептидаза I (ангиотензин 1-превращающий фермент) имеет последовательность в области каталитически важных остатков His и Glu весьма

о

2.6. Активные центры

93

Таблица 19. Лиганды атома цинка [1348] L4

<-t->

Фермент Функция L1 b2 L3 L4 Протоно-акцеп-торная группа

Карбоксипептидаза А Лиганд Ориентирующая группа HisigecN*1) Ser194 Glu72 His69(N*1) Asp 142 h2o Glu270

Термолизин Лиганд Ориентирующая группа His1 42 (Ne1 ) Asp170 His146(Ne1 ) Asn165 Glu 166 н2о Glu143

сходную с термолизином, у этого фермента есть два потенциальных Zn-связыва-ющих центра, расположенных в разных доменах молекулы, однако фермент способен связывать лишь 1 г-атом Zn/моль белка [13501. Последовательность в области каталитически активного остатка Glu в ангиотензинпревращающем ферменте имеет значительно большее сходство с последовательностью карбоксипептидазы А (вблизи Glu270), чем с термолизином [13511.

Arg145

Рис.27. Стереоизображение области активного центра карбоксипептидазы А [1491

Атомы С боковых цепей каталитически важных остатков Arg145, Туг248 и Glu270 (ф); атомы С, N и О основной цепи (О)

94 Глава вторая. Ферменты

Важные для катализа остатки глутаминовой кислоты обнаружены методами химической модификации и направленного мутагенеза в нейтральной протеазе Аеготопаз sp. [1352] и эндопептидазе "24.11" [1353]. В активном центре лей-цинаминопептидазы в связывании иона Zn2+, по-видимому, участвует SH-rpynna остатка цистеина [1354,1355](см., однако: [1356]).

2.6.5. Сходство и различия в структуре активных центров ферментов, относящихся к разным группам

Как видно из изложенных выше данных, внутри каждой группы ферментов наблюдается очень большое сходство в строении активных центров. Это сходство проявляется даже у ферментов, первичные и общие пространственные структуры которых заметно различаются. Различия в строении активных центров внутри группы связаны в основном с различиями в их специфичности. Не следует, однако, забывать, что эти выводы базируются на данных по исследованию очень небольшого числа представителей каждой группы ферментов.

Представляет интерес вопрос о сходстве и различиях в структуре активных центров ферментов, относящихся к разным группам.

Такое сравнение между сериновыми и тиоловыми протеазами [1357], серино-выми и металлсодержащими [1348] и аспартильными и металлсодержащими [1358] ферментами выявляет определенное сходство в геометрии всех четырех групп амидгидролаз или по крайней мере их представителей, изученных методами рентгеноструктурного анализа. Отмечена также близость в расположении групп активных центров трипсина и термолизина с группами фосфолипазы А2 [1359).

Как видно из табл.20, наложение структур активных центров химотрипсина и папаина приводит к различиям в положении функционально важных атомов, не

о

превышающим 1 А.

Таблица 20. Расстояние в активных центрах химотрипсина и папаина при наложении структур [1357]

Химотрипсин Папаин о Расстояние, A

His 57 NS1 His 159 Ne2 0,4

His 57 Ne2 His 159 Ns1 0,8

Asp 102 ст Asn 175 CT 0,9

Asp 102 0S1/0S2 Asn 175 0S1/N52 0,7

Ser 195 от Cys 25 ST 1 ,0

Таблица 21. Сравнение положения эквивалентных групп в трипсине и термолизине [1348]

Группа Трипсин Термолизин о Расстояние, A

Нуклеофил Анионный центр Акцептор протона Ser 195 0Т Gly 193 NH His 57 Ne2 0H2-Zn Zn Glu 143 0e2 0,6 2,1 2,1

2.6. Активные центры

95

Сравнение положения эквивалентных по функциям атомов и групп в трипсине и термолизине (комплексы с квазисубстратами) показывает, что активные центры этих двух ферментов заметно различаются (табл.21).

Протонакцепторные группы, соответственно His57 и Glu143, хотя и отличаются по положению, но располагаются по одну сторону от участка, предположительно занимаемого гидролизуемой связью.

2.6.6. Структура активных центров протеаз в кристаллах и растворе

В какой мере данные, полученные в результате рентгеноструктурного анализа ферментов, отражают структуру их в растворе? К сожалению, сейчас нет методов, позволяющих определить пространственное положение атомов белка в растворе с достаточной точностью. Те физико-химические методы, которые применяются для характеристики белковой молекулы, или имеют слишком низкое разрешение, или дают суммарные данные, которые трудно связать с конкретными атомами и группами белка. Поэтому поставленный выше вопрос до сих пор не может считаться решенным [1360].

Известно, однако, что выводы, получаемые на основе анализа строения кристаллов, как правило, хорошо согласуются со свойствами белков в растворе. Отсюда следует, что в большом числе случаев белок при кристаллизации не претерпевает существенных структурных изменений.

Расхождения могут возникать в следующих случаях: 1) если кристаллизация происходит в условиях, далеких от условий, в которых фермент проявляет активность; 2) если в растворе существует равновесие между несколькими формами белка, различающимися по биологической активности и по способности к кристаллизации; 3) если кристаллическая упаковка сильно искажает структуру молекулы.

Так, кристаллы химотрипсина, использовавшегося для рентгеноструктурного анализа, были получены при рН 4,5, т.е. в условиях, когда фермент практически неактивен в отношении типичных субстратов. Однако было показано [1361], что в этих условиях скорость распада ацилированных по Ser195 производных химотрипсина в кристаллах и в растворе одинакова.

Примером взаимопревращаемых форм фермента в растворе служат а- и 7-химо-трипсины, образующиеся при кристаллизации в разных условиях [1362]. Эти формы в растворе очень медленно превращаются одна в другую. а-Химотрипсин несколько отличается по свойствам от 7-формы [1363]. Таким образом, а- и 7-химотрипсины в растворе, по-видимому, имеют несколько различающуюся структуру. В то же время сравнение третичной структуры кристаллов этих форм химотрипсина [1227,13641 не выявило какой-либо существенной разницы между ними. Следует, однако, отметить, что согласно последним данным [12281 7-хи-мотрипсин возможно является комплексом (или ацилферментом) белка с тетра-пептидом.

Исследование 15№-ЯМР-спектров а-литической протеазы в растворе и в твердом состоянии не обнаружило каких-либо существенных различий этих двух состояний фермента [1365].

96 Глава вторая. Ферменты

Наиболее драматическим примером различий структуры фермента в кристалле и растворе является карбоксипептидаза А. Уже после появления рентгенострук-турных данных выяснилось, что: 1) характер кинетических зависимостей кар-боксипептидазы А в кристалле и растворе различен [1366,1367]; 2) различно и окружение хромофорных меток, введенных в Туг248 в кристалле и растворе [1368-1 370].

Причина этих различий, вероятно, в том, что использованные для ренгено-структурного анализа кристаллы карбоксипептидазы А имели необычную форму и кристаллографические характеристики [1371]. Было показано также, что конформации карбоксипептидазы В различаются в кристалле и растворе [1372]. Подобное положение отмечалось и для ферментов других классов (см., например: [1373]).

Таким образом, нельзя быть a priori уверенным, что найденная конформация белка в кристалле отвечает положению, которое существует для этого белка в растворе. В каждом случае этот вопрос должен быть подвергнут специальному анализу. Многообещающая возможность в этом отношении открывается в связи с применением синхротронного излучения в кристаллографии белков, что позволяет изучать реакции в кристаллах в миллисекундном интервале времени [1374).

2.7. Конфориационная подвижность ферментов

Известны многочисленные данные, свидетельствующие о подвижности групп в белковых молекулах и многообразии конформационных состояний белков в целом (см. обзоры: [1375-1379]. Во многих случаях изменение конформации происходит при изменении внешних условий (рН, температура и т.п.) или же при присоединении лигандов. Однако и при фиксированных условиях белки, по-видимому, существуют в нескольких или многих состояниях, взаимопревращения между которыми происходят достаточно быстро. Это следует, во-первых, из экспериментов по изотопному обмену протонов в белках, выявляющему наряду с быстрой стадией обмена также и более медленную стадию, которую относят к обмену протонов внутри глобулы, скорость которой лимитируется скоростью конформа-ционного изменения белка [1380]. Во-вторых, такие изменения можно проследить, используя "репортерше группы", введенные в белок, и исследуя спектральные или иные физико-химические изменения, происходящие с белком. Например, в случае модифицированной карбоксипептидазы удалось обнаружить рН-не-зависимый конформационный переход с кажущейся константой скорости около Б с-1 [1381]. Далее конформационная подвижность в белках прослеживается методами ядерного магнитного резонанса высокого разрешения [1382] по положению и форме сигналов от отдельных атомов и групп. Существует много других способов констатации конформационных изменений в белках [1383-1385], рассматривать которые здесь не представляется возможным. Единственно хотелось бы упомянуть о принципиальной возможности априорного расчета относительно небольших белковых молекул, дающего сразу сведения об энергиях большого набора состояний белка и, следовательно, о его конформационных возможностях [153,1386], а также о возможности компьютерного моделирования подвижности белков методами молекулярной динамики [1387,1388].

2.8. Протеолитическая активность других ферментов

97

2.8 Протеолитическая активность иных, чем амидгидролазы,ферментов. Каталитически активные антитела

Способность катализировать гидролиз амидной связи была выявлена у ферментов подклассов 3.1 и 3.2, а именно у лизоцима [1389,13901 и холинэстераз [1391,13921. Протеолитическая активность лизоцима может быть причиной артефактов при выделении микробных белков путем лизиса клеточной стенки бактерий этим ферментом.

В 1987 г. одновременно двумя группами исследователей была открыта способность некоторых специально полученных антител катализировать гидролитические и другие реакции [1393,13941.

Метод получения таких антител заключается в иммунизации животных так называемыми аналогами переходных состояний субстратов (см. гл.Б). Например, для эфиров типа I такими аналогами служат фосфонаты II [13951:

Удается найти клоны, Гфодуцирующие антитела, активные в отношении гидролиза соответствующих эфиров и проявляющие свойства, близкие к ферментам. В частности, они обладают определенной стереоспецифичностью, способны осуществлять синтез амидной связи [1396,13971. Каталитическая активность таких антител достигает шести порядков [13981. Получены антитела с искусственно введенными имидазольными группами [13991 (см. обзор: [14001).

2.9. Заключение

Гидролиз амидной связи катализируется многочисленными ферментами, разнообразие свойств и строения которых очень велико. Несмотря на такое разнообразие, большинство, если не все ферменты этого класса, можно свести к четырем основным группам, отличающимся структурой каталитического аппарата и, по-видимому, механизмом каталитического действия. В каждой группе можно выделить несколько подгрупп, ферменты которых заметно отличаются по своей первичной и пространственной структуре от ферментов других подгрупп той же группы. Однако в области активного центра, насколько можно судить по имеющимся сравнительно немногочисленным данным, сходство остается еще весьма высоким. Более того, можно отметить определенные общие черты структуры ферментов, относящихся к разным группам. Все это, по-видимому, отражает единство функции амидгидролаз. Наблюдаемые отличия связаны, с одной стороны, с эволюционной предысторией данного типа ферментов, а с другой - с особенностями структуры субстратов этих ферментов. Поскольку структура самой расщепляемой амидной связи мало зависит от строения остальной части молекулы субстрата, важнейшие особенности катализа реакции гидролитического расщепления амидов должны иметь между собой много общего, и это общее и проявляется в сходстве активных центров амидгидролаз.

О

I

О

II

7. В-К. Антонов

Глава третья

НЕФЕРМЕНТАТИВНЫЙ ГИДРОЛИЗ. МОДЕЛИ

Современные представления о механизмах ферментативных реакций многим обязаны обширным исследованиям неферментативных процессов, катализируемых относительно простыми соединениями. Это особенно относится к гидролитическим превращениям производных карбоновых кислот, являющимся объектом детального изучения на протяжении нескольких последних десятилетий (см. обзоры: (8, 1401 -14063).

3.1. Термодинамика

Гидролиз амидов в водных растворах при значениях рН, близких к нейтральным, фактически является суммой трех процессов:

1 . R-CONH-R + Н20 — R-COOH + H2N-R

ЙА _ +

2. R-COOH ^-^ R-COO + Н+

Кв

3. R1-NH2 + Н+ ^—^ R1-NH3

Кс

R-CONH-R1 + Н20 ^—* R-COO- + +H3N-R1 (1 )

Таким образом, наблюдаемая в эксперименте константа равновесия реакции гидролиза (Кс) равна

[R-COO-].(+H3N-R1]

Кс = - = VW (2)

[RCONHR1].[H20]

где - константа равновесия собственно гидролитической реакции; К - константа диссоциации образующейся кислоты; константа ассоциации (прото-нирования) амина. В выражении для Кс активность воды принимается за единицу. Заменяя Кв обычно используемой константой диссоциации сопряженного основания (Яш), получим

Кс = VVkbh или в терминах свободной энергии

ДСС = ДСН + ДСА - дСш. (4)

Зная экспериментальное значение константы равновесия (и изменения свободной энергии) при данном рН и температуре, а также значения изменения свободной энергии при ионизации кислоты и основания, можно вычислить изменение свободной энергии собственно реакции гидролиза.

При биохимических исследованиях принято выражать изменение свободной энергии системы при рН 7,0. Поэтому значение дС должно быть определено или рассчитано для этого значения рН. То же относится и к изменениям свободной

3.1. Термодинамика

99

энергии ионизации, которые рассчитываются для концентраций компонентов при рН 7. Эти величины связаны с КА и К следующими выражениями:

дс?

-RTln(1 +

А

10

-7'

+ гачпо+ж.),

А

д&

вн

-ДТ1п(1 +

10

-7

-) + ДГШ(-

квн+1

к.

-).

(5)

(6)

вн

Как видно из приведенных в табл.22 данных, -^мл/мам сама реакция гидролиза является эндоэргической, т.е. происходит с поглощением энергии. Ионизация образующихся кислоты и основания проходит с выделением энергии. Вследствие этого суммарное изменение стандартной свободной энергии Гиббса для пептидов в интервале рН от 4 до 7 близко к нулю (рис.28).

Величина изменения свободной энергии (Дбн) мало зависит от строения пептидов. Наибольшие изменения этой величины наблюд

страница 15
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы авокад сзао
стоимость заправки холодильника жуковский
где состоится концерт гарика сукачева в москве 9 декабря
садовые качели стандарт 2

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(06.12.2016)