химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

вающий участок активного центра.

Дальнейшие успехи в установлении строения активных центров сериновых протеаз обусловлены главным образом результатами рентгеноструктурного анализа. Было установлено, что гидроксильная группа Ser195 и имидазольное кольцо Н1з57 расположены в а-химотрипсине вблизи поверхности молекулы в области низкой электронной плотности. Эта область в молекулах ацилированных по Ser195 производных (или тозилированном производном) занята боковой цепью (обычно ароматической группой) ацильного остатка и носит название "тозиль-ная яма". Ne2-Atom остатка Hls57 расположен довольно близко к От-атому остатка Ser195.

В ходе кристаллографических исследований было установлено, что ИС1-атом

2.6. Активные центры

87

His57 взаимодействует с карбоксильной группой остатка Asp102 (ранее считавшейся остатком аспарагина). Близкое расположение трех функциональных групп Asp102, His57 и Ser195 позволило сформулировать гипотезу активации гидрок-сильной группы Ser195 путем переноса протона на Asp102 по так называемой цепи переноса заряда [1327]:

В дальнейшем концепция цепи переноса заряда в нативном ферменте подвергалась критике и в настоящее время ставится под сомнение многими исследователями (подробнее см гл.7.).

Исследование кристаллов стабильных О-ацилпроизводных а-химотрипсина позволило обнаружить взаимодействие карбонильного кислорода ацильной группы с КН-группами остатков Ser195 и Gly193 в основной цепи фермента. Эти группы образуют так называемую оксианионную полость [1328]. Наконец, исследование модифицированных по Hls57 пептидными хлорметилкетонами кристаллов 7-химо-трипсина дало возможность идентифицировать [1329,1330] группы фермента, входящие в субстратсвязывающий участок. Это 'полипептидная цепь остатков 214-216, с которыми пептидный субстрат образует, по-видимому, антипараллельную р-структуру.

На рис.24 представлена модель расположения атомов в активном центре

О 1 © 2 • 3

Рис.24. Область активного центра протеазы А из Streptomyces grlseus [1254] Пунктиром показаны водородные связи; Q - молекула воды; 1- углерод, 2- азот, 3- кислород

88 Глава вторая. Ферменты

близкого аналога а-химотрипсина - протеазы А из Streptomyces griseus, для которой рентгеноструктурные данные были получены с высоким разрешением

о

(1,5 А). Эта модель практически не отличается от модели для а-химотрипсина,

о

полученной с разрешением 1,68 А.

"Тозильная яма" - участок связывания боковой цепи субстратной аминокислоты, образующей своей карбоксильной группой расщепляемую связь - представ-

о

ляет собой довольно узкую щель, размеры которой таковы (12*6,5x4 А), что в ней может разместиться ароматический остаток фенилаланина, тирозина или триптофана. Этот участок активного центра образован преимущественно боковыми цепями неполярных аминокислот и пептидными связями основной цепи (190-191, 191-192 и 215-216). В глубине "ямы" расположены важные остатки, определяющие специфичность фермента. Это остаток Ser189 в а-химотрипсине и остаток Asp189 в трипсине. Остатки Gly216 и Gly226 в химотрипсине и трипсине индифферентны в отношении связывания субстрата, но у эластазы, специфичной к неполярным аминокислотным остаткам с короткой боковой цепью, в этих положениях имеются остатки Val216 и Thr226, препятствующие вхождению в полость объемистых боковых цепей субстрата. "Тозильная яма" в а-химотрипсине и родственных ферментах экранирована от окружающей среды боковой цепью остатка Met192.

Участки активного центра сериновых протеаз, ответственные за связывание С-концевого фрагмента субстрата (уходящей группы), были идентифицированы при изучении комплексов трипсина и химотрипсина с природными белковыми ингибиторами сериновых протеаз. Такими участками являются дисульфидная связь 42-58 (химотрипсин), область рядом с остатками Hls40 и Gly193, а также остаток Туг151 (в трипсине).

Важное значение для активности сериновых протеаз имеет ионная пара, образуемая в ферменте карбоксилат-ионом Asp194 и аммонийной группой 11е16. Эта ионная пара может рассматриваться как регуляторный участок фермента. Она отсутствует в зимогенах и образуется при активации последних. При этом, как полагают, происходит окончательное формирование активного центра фермента. Изменение рН в щелочную область приводит к разрушению ионной пары и переходу фермента в новую, неактивную конформацию.

Описанное выше строение активных центров сериновых протеиназ характерно с небольшими вариациями для всех изученных ферментов этой группы. Показательно в этом отношении состояние активного центра в субтилизинах и других микробных сериновых протеиназах. Как уже отмечалось, отсутствует гомология в первичной структуре субтилизинов и панкреатических ферментов. Отсутствует также сходство в пространственной структуре в целом. Однако строение активных центров у этих двух типов сериновых протеиназ очень сходное. Основные различия химотрипсина и субтилизина заключается в том, что "тозильная яма" в первом случае представляет собой узкий карман, в котором положение ароматической группы субстрата жестко фиксировано. Во втором случае аналогичный участок преДставляет собой щель, с одной стороны доступную растворителю. Таким образом, ароматическое кольцо субстрата в комплексе с субтилизином взаимодействует с ферментом лишь одной стороной Иззо).

Другое отличие заключается в отсутствии у субтилизинов кислого остатка

2.6. Активные центры

89

гомологичного Asp194 в химотрипсине. Соответственно N-концевые последовательности этих ферментов отличаются от последовательностей сериновых протеаз животных.

2.6.2 Цистеиновые амидгидролазы

Представители этой группы ферментов инактивируются реагентами, взаимодействующими с тиоловыми группами - п-хлормеркурибензоатом И331], йодацетатом и йодацетамидом [1332] и т.п. Было показано, что при инактивации реагирует одна SH-rpynna остатка Cys25 И 3331 (нумерация последовательности папаина). Этот остаток локализован у большинства ферментов животных калпаины, ка-тепсины В, L и др.) и растений (папайи, актинидии, химопапаин и др.) в последовательности Gly-Xaa-Cys-Trp, где Хаа - разные для разных ферментов остатки. У микробных цистеиновых протеаз (стафиллококовой протеазы, клострипаи-на) эта последовательность несколько отличается [720,726,728,735,747,752, 1334-1336]. Рентгеноструктурный анализ папаина и актинидина показал, что этот остаток расположен в протяженной щели на границе двух доменов фермента (рис.25). Он может быть превращен в дегидроаланиновый или глициновый остатки с полной потерей активности [1337]- В непосредственной близости к SH-группе располагается имидазольная группа остатка H1S159, 1-атом которого образует с SH-группой Cys25 водородную связь. Второй Ne2-aTOM Hls159

образует водородную связь с 0е1-атомом остатка Asn182. Эта водородная связь расположена в неполярном окружении и защищена от контакта с растворителем индольным кольцом Тгр184. Роль остатка Hls159 в катализе первоначально ставилась под сомнение, поскольку рН-зависимость катализа показывает участие непротонированной группы с рКа 4,2. Это значение рКа приписывалось карбоксильной группе остатка аспарагиновой кислоты. Однако кристаллографические данные показали, что ближайшая к Cys25 карбоксильная группа

о

(Asp158) находится от SH-группы на расстоянии ^,5 А. По-видимому, низкое значение рК гистидина обусловлено взаимодействием с тиолат-ионом Cys25.

Хотя существует формальная аналогия между системой Asn182-Hls159-Cys25 и системой переноса заряда в химотрипсине (Asp102-Hls57-Ser195), очевидно, что у цистеиновых протеиназ такая система отсутствует и роль связи Asn182-Hls159 заключается в фиксации положения имидазольного кольца гистидина.

В активном центре цистеиновых протеиназ расположена также боковая цепь остатка Gln19. Ее 0е1-атом образует водородную связь с От-атомом остатка Ser183.

о 2

Л 3

Рис.25. Область активного центра папаина [1262]

Пунктиром показаны водородные связи. М - метанол (кристаллизационный), 42 - молекула воды, 7 -углерод, 2 - азот, з - кислород

90 Глава вторая. Ферменты

Окружающие активный центр боковые цепи неполярных аминокислот образуют связывающий субстратный участок. Довольно глубокий "карман", удаленный от каталитически активных групп настолько, что он, по-видимому, связывает второй (Р2) от расщепляемой группы остаток субстрата (в сторону N-конца), образован боковыми цепями Тугб7, Рго68 и Val133 и Val157 второго домена.

Глубина щели активного центра по оценкам, сделанным с помощью спин-ме-

о

ченных производных папаина [1338] составляет около 10 А. В фицине эта вели-

о

чина несколько меньше (r? А) [1339].

В цистеиновых протеиназах не обнаружено групп, которые могли бы играть регуляторную роль, подобную той, какую выполняют остатки Asp194 и 11е16 в а-химотрипсине.

2.6.3. Аспартатные амидгидролазы

Аспартатные амидгидролазы функционируют в кислой или слабокислой среде, и поэтому, естественно, было ожидать, что в качестве каталитически активных групп у этих ферментов выступают карбоксильные группы, практически единственные в белках, способные ионизироваться в этих условиях. Действительно, было обнаружено [1340,1341], что некоторые реагенты на карбоксильные группы полностью инактивируют аспартатные протеазы. К таким реагентам относятся диазокетоны - производные ациламинокислот и пептидов [1342,1343], а также некоторые эпоксисоединения [1344]. Диазокетоны в присутствии солей меди реагируют с одной и вполне определенной группой в пепсине - карбоксильной группой остатка Asp215. Реакция идет, по-видимому, через образование карбе-на, который и является реакционноспособной частицей (см. гл.5).

Анализ последовательности аминокислот вблизи модифицируемой группы у разных аспартатных протеиназ показал значительную консервативность этого участка (см. табл.16).

Эпоксисоединения, например п-нитрофеноксипропилоксид

о

реагируют с другой карбоксильной группой, принадлежащей в последовательности пепсина остатку Asp32 [1344]. Кроме того, этот реагент в определенных условиях реагирует также с остатком Asp215, присоединяясь своей вторичной гидроксильной группой [1345]- Последовательность остатков в области Asp32 также весьма консервативна. Обращает на себя внимание сходство в последовательностях пептидов в области Asp32 и Asp215, что, по видимому, обусловлено эволюционными особенностями аспартатных протеиназ, о которых говорилось выше.

Оба каталитически важных остатка Asp32 и Asp215 расположены в глубине протяженной щели, образованной двумя доменами белка и пересекающей практически всю глобулу (рис. 26). Карбоксильные группы этих остатков расположены близко одна от другой и образуют между собой водородную связь. Остаток Asp32 погружен в глобулу белка и образует водородные связи с От-атомом ос татка Ser35, NH-группой остатка Gly34 в основной цепи и с молекулой воды.

2.6. Активные центры

91

Карбоксильная группа Asp215 находится в весьма сходном окружении. Она образует, кроме связи с Asp32, еще и водородные связи с 07-атомом остатка Thr218, Ш-группой остатка Gly217 и той же молекулой воды. Эта молекула воды (у пепсина N355) лежит между двумя карбоксильными группами активного центра в плоскости группы Asp215. Вблизи этих груш имеются еще по крайней мере две молекулы воды, одна из которых, по-видимому, играет важную роль в катализе (см. гл.7), из других функциональных групп белка, расположенных в области активного центра, следует отметить СООН-группу Asp304, образующую Н-связь с пептидным карбонилом основной цепи остатка Thr2l6, ионную пару, образованную остатками Lys308 и Asp11, и гидроксильную группу остатка

РИС.26. Активные центры четырех аспартильных протеаз, наложенные один на другой (стереоизображение)

Жирные линии - пепсин, • - вода; тонкие линии - пенициллопепсин, Д - вода; короткий пунктир - ризопуспепсин, d - вода; длинный пунктир - эндотиапеп-син, о - вода [1270]

Туг75. Остаток Туг75 расположен в петле, частично прикрывающей щель активного центра. При повороте вокруг связи С^-С^ гидроксильная группа этого остатка сближается с карбоксильными группами остатков Asp215 и Asp32.

В области активного центра расположены боковые цепи остатков Рпе189 (в пенициллопепсине или Туг189 в пепсине), 11е213 и Туг299 (в пепсине Leu299), которые могут формировать гидрофобные связывающие участки фермента.

Значительно отличающаяся от рассмотренных выше ферментов - протеаза В Scytalldlvm llgntcolm, нечувствительна к большинству специфических ингибиторов аспартатных протеаз. В активном центре этого фермента функционирует остаток глутаминовой кислоты [13461. Интересно, что последовательность аминокислот вблизи этого остатка гомологична последовательности в области активных центров других аспартатных протеаз:

92 Глава вторая. Фериенты

протеаза В:

CysGlnThrAlalleLeuGluTnrGlyPhe

пепсин: (32)

PheThrValllePheAspTnrGlySer

(215)

AlalleLeuAspTnrGlyThr

Наконец, следует упомянуть протеазы ретровирусов, которые, как указывалось, в димерном состоянии функционируют по типу аспартатных протеаз. Роль каталитически активного остатка у протеазы вируса иммунодефицита человека играет остаток Asp25. По-видимому, при димеризации этот остаток в каждом из протомеров занимает положение, соответствующее остаткам Asp32 и Asp215 в пепсине [1347].

2.6.4. Металлсодержащие амидгидролазы

Изученные в отношении структуры активного центра ферменты этой группы содержат связанные с белком атомы цинка. Несмотря на большие различия первичной структуры и пространственного строения двух основных представителей Zn-зависимых протеаз - карбоксипептидазы А и термолизина, строение их активных центров очень сходно [1348,1349].

Ион Zn2+ в карбоксипептидазе и термолизине имеет четыре координационные связи. Из них три образованы с функциональными группами белковой молекулы и одна - с молекулой воды- В координационной сфере металла в обоих случаях имеется по два остатка гистидина и по одному остатку глутаминовой кислоты. Однако взаимное расположение этих остатков в карбоксипептидазе А и термолизине разное (табл.19).

Наряду с группами, непосредственно входящими в координационную сферу атома Zn, имеются группы, ориентирующие имидазольные кольца двух лигандов по отношению к атому цинка (рис.27). Эти группы различны у карбоксипептидазы и термолизина. Далее в непосредственной близости от атома цинка (<*4,2-

4,9 А) расположены остатки глутаминовой кислоты, которым приписывается роль акцепторов протона в катализе.

Вблизи атома цинка в карбоксипептидазе имеется гидрофобный "карман", образованный боковыми цепями остатков Туг192 и Phe279. В непосредственной близости от него расположена гуанидиновая группа остатка Arg145 и феноль-ная группа остатка Туг248 [149].

В термолизине область, расположенная вблизи атома цинка, является более протяженной, чем в карбоксипептидазе. Она образуется ароматическими остатками Тгр115 и Рпе114, а также группой гидрофобных боковых цепей Val 139, Leu133, Phe130, Leu202 и Val192. Наиболее существенное отличие этого фермента от карбоксипептидаз заключается в том, что в активном цент

страница 14
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
реклама наружка
элитная hi fi акустика
сигнализация старлайн а 91
шоу джеки чана купить билеты

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)