химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

208 по 212, а домен R - остатками с 1 по 9 и с 112 по 207, т.е. в оба входят как остатки К-концевой, так и С-концевой последо-

Рис.18. Стереоизображение доменов L (N-концевой) и R (С-концевой) папаина [1262]

Пунктирными линиями изображены водородные связи между атомами основной цепи

80 Глава вторая. Ферменты

вательности. Оба домена имеют "ядра", образованные боковыми цепями неполярных остатков, тогда как поверхность их контакта образована в основном боковыми цепями полярных аминокислот и содержит значительное число молекул свя-занноЯГводы. Из трех дисульфидных мостиков два (22-63 и 56-95) включены в домен L и один (153-200) - в домен R (рис.18). Вторичная структура папаина и актинидина относится к типу а+р (см. рис.10), причем домен L содержит преимущественно а-спиральные конформации, а домен R - в основном нерегулярные, скрученные р-слои. В папаине содержатся три спиральных участка (остатки 24-43, 50-57 и 67-78) в домене L и два спиральных участка (117-127 и 138-143) в домене R. Средняя длина водородных связей в спиральной структуре

о о

2,98- 2,99 А, что выше, чем для идеальной а-спирали (2,87 А).

Участок р-структуры домена R состоит в основном из четырех антипарал-лельных тяжей. Почти все остатки, входящие в р-структуру имеют двугранные углы <ф>м-121° и <ф><«1430, что характерно для правоскрученных р-складчатых листов. Все четыре центральных тяжа р-структуры погружены в область домена R. Они построены преимущественно из неполярных аминокислотных остатков, причем полярные остатки расположены на концах тяжей.

Как уже указывалось, каждый домен имеет гидрофобное ядро, образованное боковыми цепями неполярных остатков аминокислот. Это преимущественно остатки валина, лейцина и изолейцина. Что касается ароматических остатков, то они лежат в основном на периферии близко к ее поверхности или даже на поверхности так, что одна часть ароматического кольца контактирует с раствором. Практически не наблюдается ориентации, типичных для ¦гс-тс-взаимодейст-вий.

Остатки заряженных аминокислот расположены на поверхности молекулы, однако они не образуют какого-либо участка с высокой концентрацией зарядов, а распределены достаточно равномерно. Одна основная заряженная группа (Lys181) и три кислых группы (Glu35, Glu50 и Glu52) погружены внутрь молекулы и недоступны растворителю. Заряды некоторых из этих групп (но не всех) нейтрализованы.

Интересно отметить, что как в актинидине, так и в папаине один из остатков пролина (Pro155) находится в цис-конфигурации.

2.5.3. Аспартатные амидгидролазы

о

Кристаллографический анализ с разрешением менее 3 А был осуществлен для ряда аспартатных протеиназ животных, микроорганизмов и вирусов. Несмотря на заметные различия в последовательности аминокислот пепсина и ферментов из микроорганизмов, пространственно эти протеазы оказались очень сходными (см., например, рис.19). Характерным для этих ферментов является наличие, как и в случае цистеиновых протеаз, двухдоменной структуры. Более того, внимательное изучение хода полипептидной цепи в пепсине позволило Изоо, 1301] внутри каждого домена выявить по два "субдомена" с повторяющейся пространственной организацией (рис.20). Это несомненно отражает процесс эволюции аспартатных протеаз, основным моментом которой является дубликация генов [1302,13031.

Аспартатные протеазы практически целиком построены из р-структур. Имеются всего лишь четыре коротких участка деформированной а-спирали. У пеницил-

2.5. Пространственная структура

81

РИС.19. Стереопары хода полипептидных цепей пепсина свиньи (а) и пеницилло-пепсина (б) [1268,1276]

лопепсина это остатки 58-62, 137-141, 225-235 и 303-309 (нумерация по последовательности свиного пепсина). р-Структуры у этих ферментов образуются тяжами и "шпильками", соединенными короткими участками с неупорядоченной структурой. Каждый "субдомен" построен довольно однотипно: если двигаться от N-конца к С-концу молекулы, то сначала идет р-шпилька, затем - петля, далее - короткая спираль и снова р- шпилька с противоположной по сравнению с первой шпилькой ориентацией. В молекуле фермента эта структурная организация повторяется 4 раза. Ядро каждого домена образуется р-слоем, состоящим

6. В.К. Антонов

82 Глава вторая. Ферменты

из двух-широких петель, входящих одна в другую. В основном наблюдается удивительная симметричность доменов и молекулы фермента в целом.

Молекула ренина построена аналогичным образом. Среднее квадратичное отклонение атомов основной цепи от положения этих атомов в протеиназах микро-

о

организмов составляет 0,45А[1275К

Протеазы ретровирусов, хотя и являются аспартатными протеазами, имеют очень низкую степень гомологии первичной структуры с аспартатными протеазами животных и микроорганизмов. Их размеры обычно вдвое меньше, чем размеры типичных ферментов этой группы, однако активные формы ферментов представляют собой димер [939, 1304]. Структура димера очень сходна со структурой пепсина, особенно в области активного центра, образуемого группами двух протомеров. Вероятно, в стабилизации димера важную роль играют N- и С- концевые остатки молекулы протомера.

Из этой группы ферментов пространственная структура с разрешением около 1,6

о

А известна для карбоксипептидазы А и термолизина. Более низкое разрешение достигнуто для карбоксипептидаз В и Т и для нейтральной протеазы Bacillus cereus. Как уже отмечалось выше, в первичной структуре карбоксипептидаз и термолизина наблюдается очень мало сходства. Пространственные структуры этих ферментов также сильно различаются [1292]. Термолизин по классификации вторичных структур относится к группе а+р, а карбоксипептидаза А - к группе а/р. Оба фермента заметно отличаются даже по размерам молекул, хотя у них близкие молекулярные массы. Карбоксипептидаза А имеет почти сферическую

о

симметрию (50x42x38 А), тогда как термолизин представляет собой вытянутый

о

ЭЛЛИПСОИД (64x38x37 А).

Термолизин - двухдоменный белок (рис.21). N-Концевой и С-концевой домены соединены участком, включающим остатки 153-158. Каждый домен имеет почти сферическую симметрию. а-Спиральные структуры составляют около 38% всех аминокислотных остатков, причем большая часть спиральных участков расположена в С-концевом домене. Соответственно N-концевой домен построен преимущественно из р-складчатых слоев, включающих около 70 остатков. Эти слои, как и в а-химотрипсине, образуют "цилиндр". Граница двух доменов образована преимущественно гидрофобными боковыми цепями остатков Рго130, Leu133, Val139, Ile188, Val192, Leu202. Ряд заряженных боковых цепей расположен внутри молекулы, и их заряды компенсированы ионными взаимодействиями. Тер-

Рис.20. Чередование вторичных структур в молекуле пепсина [1268] 1 - тяжи при рассмотрении с N- и С-концов; 2 - (з-шпилька; 3 - а-спираль (пунктирной линией обведена структурная единица молекулы, которая повторяется 4 раза)

2.5.4. Металлсодержащие амидгидролазы

2.5. Пространственная структура

83

РИС.21. Конформация основной цепи термолизина [1291]

2+ 2+ 7 - атом Zn ; г - атом Са

молизин характеризуется значительным содержанием солевых мостиков.

Термолизин содержит 3-4 атома кальция. Два атома кальция находятся всего

о

лишь на расстоянии 3,8 А один от другого. Образуемые атомами Са солевые связи включают остатки Asp57, Asp138, Asp185 и Asp200 и остатки Glu177,

о

Glu190. Ближайший к атому Zn атом Са находится от него на расстоянии »13 А. Два атома кальция, го-видимому, играют важную роль в стабилизации взаимного расположения двух доменов.

В отличие от термолизина карбоксипептидаза А (рис.22) - однодоменный белок. Общее содержание а-спиральных структур составляет 38$, а р-структур -

84 Глава вторая. Ферменты

Рис.22. Ход полипептидной цепи карбоксипептидазы А [149]

17%. Таким образом, значительная часть белковой молекулы имеет неупорядоченную структуру.

В последовательности аминокислот белка спиральные участки чередуются с р-структурами и короткими неупорядоченными структурами. Лишь в средней части последовательности имеется значительный участок неупорядоченной структуры (остатки 122-174). Слои р-структуры организованы как в антипараллельные, так и в параллельные тяжи. Интересно, что пептидная связь между остатками Ser197 и Туг198 имеет ци-с-конфигурацию.

Суммарно боковые цепи 164 остатков аминокислот карбоксипептидазы А экспонированы в раствор, 78 боковых цепей маскированы внутри глобулы и 65 расположены на поверхности молекулы, лишь частично контактируя с растворителем.

Что касается структуры нейтральной протеазы Bacillus сегеиз, то она довольно близка структуре термолизина (среднеквадратичное отклоне-

о

ние 0,88 А), тогда как карбоксипептидазы В и Т по своей пространственной организации сходны с карбоксипептидазой А.

Следует упомянуть имеющиеся данные элект ронно-микроскопического изучения лейцинамино-пептидаз из хрусталика глаза быка и почек свиньи [1305,1306]. Этот фермент, состоящий из 6 субъединиц, по-видимому, организован так, как это показано на рис.23.

Рис.23. Модель субъединичной организации молекулы гексамера лейцинаминопепти-дазы почек свиньи [1306] Вид вдоль оси 0

2.6. Активные центры

Молекула субстрата или та часть субстрата, которая непосредственно взаимодействует с ферментом в ходе катализа, существенно меньше, чем молекула фермента. Поэтому все события, разыгрывающиеся при катализе, происходят в

2.6. Активные центры

85

ограниченной области фермента, называемой активным центром. Активный центр может быть определен как совокупность атомов фермента, участвующих в связывании и.зхитческом превращении субстрата. Это определение, как и всякое, страдает неполнотой, поскольку очень трудно точно указать, какие атомы фермента участвуют в катализе и что означает само слово "участвуют". Кроме того, на разных стадиях каталитического превращения могут принимать участие разные атомы фермента. Вместе с тем все же можно достаточно определенно ограничить область активного центра в пространственной структуре большинства ферментов. В активном центре можно различить три участка: каталитический -совокупность атомов, взаимодействующих с расщепляемой группой субстрата; связывающий - участок, в котором происходит фиксация иных, чем реагирующая групп субстрата, и регуляторный - участок, взаимодействующий с внешними эффекторами и влияющий на состояние каталитического и связывающего участков. Значительная часть информации об активных центрах амидгидролаз получена методами направленной химической модификации и кинетическими методами, но наиболее подробные данные явились результатом рентгеноструктурного исследования комплексов ферментов с субстратоподобными лигандами. В последние годы для этой цели весьма успешно используется метод направленного мутагенеза [1307], позволяющий заменять одни остатки аминокислот на другие. Ниже будут изложены основные сведения, касающиеся активных центров представителей четырех групп протеиназ, а некоторые детали будут, приведены в последующих главах при рассмотрении отдельных стадий каталитического процесса.

2.6.1. Сериновые амидгидролазы

Характерным для этой группы ферментов является чувствительность к инактивации под действием диизопропилфторфосфата и других фосфорорганических соединений [1308]. Было установлено, что сериновые протеиназы взаимодействуют с диизопропилфторфосфатом, образуя фосфоэфирную связь с единственной гидрок-сильной группой, принадлежащей остатку серина [1309]. В последовательности наиболее изученного фермента этой группы а-химотрипсина реакционноспособный остаток серина занимает положение 195 [1310,1311]. Из различных ферментов группы сериновых протеиназ были выделены пептиды, содержащие реакционноспособный серин. Оказалось, что последовательность аминокислот в окружении этого остатка, для многих ферментов этой группы весьма консервативна (см. табл.14). Последовательность GlyAspSerGlyGlyPro сохраняется для всех панкреатических сериновых протеаз, протеаз крови, некоторых микробных протеаз и др. Такая же последовательность обнаружена у протеиназ и коллагеназ беспозвоночных С1312 -1314]. Однако у ферментов бактерий типа субтилизина и грибных сериновых протеиназ последовательность в области остатка серина, модифицируемого фосфорорганическими соединениями, другая - GlyThrSerMetAla. Интересно, что близкое строение имеет пептид активного центра растительной протеазы кукумизина [1315] и трипептидилпептидазы II из эритроцитов человека 11316]. У подавляющего большинства сериновых протеаз консервативным является остаток Gly193, роль которого для активности фермента можно продемонстрировать на примере а-субъединицы фактора роста нервов [1317]. В ней, в отличие от протеолитически активной 7-субъединицы, этот остаток заменен на His и а-субъединица не активна. Известна также сериновая протеаза с уни-

86 Глава вторая. Ферменты

кальной последовательностью SerSerGly [377].

Еще одну группу сериновых амидгидролаз, отличающуюся от всех рассмотренных выше, составляют D-аланинкарбоксипептидазы и р-лактамазы I, в активных центрах которых обнаруживается последовательность GlySerVal или Ala(Met)-SerMet(Thr) [257,258,1318,1319]. Остаток серина в этих ферментах реагирует с антибиотиками пенициллиновой группы [1320,1321].

Было показано также [1322], что при действии гс-нитрофенилового эфира уксусной кислоты на а-химотрипсин ацилируется тот же самый уникальный остаток Sen 95. Удалось выделить несколько относительно устойчивых производных а-химотрипсина и других сериновых протеиназ, ацилированных по Ser195 различными кислотами. Наконец, спектральные и кинетические исследования показали, что в ходе гидролиза эфиров ациламинокислот и их аналогов образуются относительно стабильные ацилпроизводные. Действие на сериновые протеиназы ди-изопропилфторфосфата и другие модификации по Ser195 полностью инактивируют фермент в отношении его каталитических функций. Таким образом, Ser195, или точнее его гидроксильная группа является важной для катализа и входит в активный центр фермента.

Другой каталитически важной группой является имидазольная группа остатка Hls57 (в последовательности а-химотрипсина). Указания на важность этой группы были получены при исследовании рН-зависимости катализа сериновыми протеазами: была обнаружена группа с рйа«7, функционирующая в непротониро-ванном состоянии. В дальнейшем удалось найти специфические соединения, реагирующие с остатком His57. Ими оказались галоидкетоны, производные ациламинокислот и пептидов [1323]:

N^JSTH+ C1CH2C0CHR2 №^NCH2COCHR2-

NHCOR NHCOR1 Эти соединения полностью инактивировали сериновые протеазы. Последовательность аминокислот вблизи остатка Hls57 также оказалась весьма консервативной для большого числа ферментов этой группы.

Значение остатка Hls57 было выявлено также при метилировании Иег-атома имидазольной группы этого остатка метиловым эфиром .я-нитробензолсульфокис-лоты [1324]. Оказалось [1325,1326], что N-метилхимотрипсин практически лишен каталитической активности, но сохраняет способность связывать субстраты. Таким образом, модификация затрагивает каталитический, но не связы

страница 13
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
керамика будущего ступени
контактные линзы maxima
Скидка за клик в KNS, промокод "Галактика" - NE51070T15P2-1041G - поставщик товаров и оборудования для бизнеса в Москве.
почасовая оплата машины с водителем

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(06.12.2016)