химический каталог




Химия протеолиза

Автор В.К.Антонов

логия отдельных участков в структуре довольно отдаленных по происхождению и специфичности металлсодержащих гидролаз (табл.17). Эта гомология особенно характерна для связывающих металл участков и каталитически активных групп.

Панкреатическая карбоксипептидаза А имеет довольно большое число форм, раз^чающихся К-концевыми аминокислотами и одной из аминокислот на С-конце молекулы. С-Концевая последовательность фермента может иметь в положении 3 с С-конца Val или Leu. Кроме того, каждая из этих форм в зависимости от условий активации зимогена и метода выделения может иметь разную длину полипептидной цепи [12131:

ее-*

HAlaArg-j-SerThrAsnThrPhe-

т-> Val

-AsnTyrAla...MetGluHisThr AsnAsnOH

Leu

Карбоксипептидаза А имеет один дисульфидный мостик, а карбоксипептидаза В - три S-S-мостика и одну свободную SH-группу [1214). Термолизин, построенный из 316 аминокислотных остатков, не содержит дисульфидных связей. Интересно отметить наличие в положениях 27-30 последовательности гидрофобных остатков TyrTyrTyrLeu. Еще более внушительный кластер гидрофобных остатков обнаружен в молекуле лейцинаминопептидазы из хрусталика глаза быка (остатки 64-69).

2.4.5. Небелковые составляющие

Молекулы многих амидгидролаз являются гликопротеинами. Это особенно характерно для внутриклеточных ферментов эукариот и ферментов крови (см.: табл. 12). Гликопротеинами являются некоторые протеазы растений, например, куку-мизин, фицин и бромелаин. У прокариот наличие сахарных остатков, связанных с белком, весьма редкое явление. Так, сахара обнаружены у лактамазы II из Bacillus cereus.

Среди Сахаров наряду с обычными гексозами часто встречаются аминосахара и сиаловые кислоты. Такие остатки заметно влияют на электрофоретическую подвижность и хроматографическое поведение белка, но, как правило, не влияют на каталитические свойства.

Существуют два типа связи олигосахаридных остатков с белком: 0-гликано-вая, когда сахар связан гликозидной связью с гидроксильными группами остатков серина или треонина и N-гликановая, где полисахаридная цепь связана с атомом азота боковой цепи остатка аспарагина. Этот последний обычно входит в последовательность Asn-X-Thr (Ser).

Другой тип небелковых составляющих встречается у мембранных ферментов. Это остаток гликозилфосфатидилинозита, выполняющего функцию "якоря" при

Таблица 17. Участки первичной структуры металлсодержащих амидгидролаз*

Номер в табл. 12 Фермент Номер остатка по последовательности карбоксипептидазы А

67 68 68'69 70 71 72 73 74 259260261262263264265266267268269270271272273

477 481 482 490 510 531 542 *Лите1 Карбоксипептидаза А, бык Карбоксипептидаза В, бык Карбоксипептидаза N, человек Карбоксипептидаза Е, бык Термолизин Коллагеназа фибробо-бластов, человек Нейтральная эндопептидаза, кролик )атурные источники см. 1 1 GI-HSREWI YNQGIKYSFTPELRD GE-HAREWI YDQGIKYSPTFELRD CNMHGNEAL YLHTNCFEITLELSC GNMHGNEAV YbSSNCPEITVELSC GGVHINSGI LSGGID-VVAHELTH GLSHSTDIG YMRTNPFYPEVEbNF GGQHLN-GI Y-GGIGMVIGHEITH •абл.12 .

2.5. Пространственная структура

73

связывании белка с лигшдной мембраной. Такой остаток обнаружен, в частности, у аминопептидазы Р из ворсинок почечных канальцев [12151.

Ряд протеаз содержит в своем составе фосфатные группы. Так, пепсин А свиньи содержит остаток фосфорной кислоты, образующий фосфоэфирную связь с гидроксильной группой Ser68 [838]. Отщепление фосфатной группы (образование пепсина D) никак не сказывается на ферментативных свойствах пепсина [1216]. Эта группа расположена в весьма подвижном участке фермента [12171.

Из необычных аминокислот следует упомянуть 7-карбоксилглутаминовую, обнаруженную в тромбине [317] и других витамин К зависимых ферментах [12181 и играющую важную роль в связывании ионов кальция.

2.5. Пространственная структура

Наиболее важной характеристикой фермента с точки зрения его каталитических свойств и механизма действия является пространственная, или третичная, структура. Сведения о пространственной структуре белков получают методами рентгеноструктурного анализа [12191, причем для суждения о деталях строения

о

молекулы необходимо разрешение как минимум 2,7-2,8 А. Важной характеристикой качества кристаллографической модели является степень уточнения, определяемая величиной так называемого R-фактора. R = S(|P0|-|PC|)/ EIF0I« гДе |Pq| и |Рс| - экспериментальные и вычисленные факторы структурных амплитуд. В настоящее время рентгеноструктурные данные с таким и более высоким разрешением получены для многих амидгидролаз, некоторых их зимогенов и большого числа комплексов ферментов с аналогами субстратов (табл.18 и гл.6).

Характерной особенностью большинства исследованных в отношении пространственной структуры амидгидролаз является низкое содержание а-спиралышх

Таблица 18. Рентгеноструктурный анализ амидгидролаз и некоторых зимогенов с высоким разрешением

Белок R-фактор* Разрешение, о А Литературный источник

Сериновые ажиВгидролазы

а^Химотрипсин быка 0,179 2,8; 2,0; 1 ,67;1 ,68 1 ,8; [1220-12261

7-Химотрипсин быка 0,173 2,7 1 ,9; 1,6 [1225,1227,1.2281

Химотрипсиноген А быка 0,173 2,5 1,8 [1229,12301

Трипсин быка 0,193 1,8 1 ,5 [1231-12361

Трипсиноген быка 0,166 1 ,9 1,8 [1237-12391

Эластаза свиньи, 0,169 2,5 1 ,65 [1240-12421

панкреатическая

Калликреин А, панкре а тиче ский 0,220 2,05 [12431

Тонин 0,196 1 ,8 [12441

Химаза II 0,191 1 ,9 [1245]

Протромбин (фрагмент 1) быка 0,240 2,8 [1246]

Трипсин Streptomyces grleeuB 0,161 1,7 [1247]

74 Глава вторая. Фериенты

Таблица 18 (окончание)

Белок R-фактор* о Разрешение, А Литературный источник

Субтилизин Вас111 us amylol iquefoci ens 0,140 1 ,8 [1248]

СуСтилизин BPN' (Novo) 0,230 2,8; 2,0 [1249,1250]

Термитаза 0,240 2,2 [1251 ]

Протеаза Streptomyces griseus A 0,126 1 ,8; 1 ,5 [1252-1254]

Протеаза Streptomyces grlseus В 2,8 [1255,1256]

а-Литическая протеаза Lysobacter enzymogenes 0,131 2,8; 1 ,7 [1257,1258]

Протеиназа К 0,167 1 ,5 [1259]

D-Аланинкарбоксипептидаза Streptomyces sp- R61 — 2,8 [1260]

в-Лактамаза Васll1ив Z icheniformiв 0,208 2,0 [1261 ]

Цистеиновые амидгидролазы

Папаин 0,161 2,8; 1 ,65 [148,1262-1263]

Актинидии 0,171 2,8; 1,7 [1263-1265]

Калотропин DI - 3,2 [1266]

Аспартатные амидгидролазы

Пепсин А свиньи 0,174 2,7; 2,0; 1,8 [1267-1270]

Пепсиноген 0,173 1,8 [1271 ,1272]

Химозин 0,165 2,3 [1273,1274]

Ренин 0,24 2,5 [1275]

Пенициллопепсин 0,136 2,8; 1 ,8 [1276,1277]

Протеаза Endothia parasitica 0,178 3,0; 2,45; 2,1 [1278-1280]

Протеаза Rhizopus chlnenele 0,143 2,5; 1 ,8 [1278,1281 ,1282]

Протеаза вируса птичьего миэлоблас тоза 0,26 2,4 [1283]

Протеаза вируса саркомы Рауса 0,15 2,0 [1284]

Протеаза вируса иммунодефицита человека (HIV-1 ) 0,184 3,0; 2,8 [1285,1286]

Металлсодержащие амидгидролазы

Карбоксипептидаза А быка 0,190 2,0; 1 ,54 [149,1287-1289]

Карбоксипептидаза В 0,33 2,8 [1290]

Термолизин 0,213 2,3; 1,6 [1291-1293]

Нейтральная протеаза Вас 111ив сereus 0,217 3,0 [1294]

Карбоксипептидаза Т 0,343 3,0 [1295]

.О-Аланил-С-аланин карбоксипептидаза 2,5 [1296]

*Для наилучшего разрешения.

2.5. Пространственная структура

75

участков. Эти белки построены из фрагментов р-структур, соединенных неупорядоченными участками. Во многих ферментах удается идентифицировать домены, из которых построены молекулы этих белков.

Как и следовало ожидать на основании сравнения последовательности аминокислот, сходные по первичной структуре белки имеют сходные пространственные структуры. Поэтому целесообразно далее рассматривать особенности третичной структуры амидгидролаз внутри каждого типа ферментов.

•149

2.5.1. Сериновые амидгидролазы

Сериновые протеазы животного происхождения - химотрипсины, трипсин и эластаза, имеющие значительное сходство в последовательности аминокислот, -также весьма близки и по третичной структуре (рис.14).

Остановимся более подробно на описании а-химотрипсина. Полипептидные цепи в нем образуют систему антипараллельных р-шпилек, связанных сеткой водородных связей. Два коротких а-спиральных участка расположены в С-концевой области цепи С (остатки 232-245) и в области остатков 165-172. Большинство р-шпилек свернуты таким образом, что

174

145

Рис.14. Сравнение хода полипептидной и эластазы (В) [1222]

цепи а.~химотрипсина (А), трипсина (Б)

76 Глава вторая. Ферыенты

Рис.15. Стереопары, показывающие структуру "цилиндров" I (а) и II (0), образованных полипептидными цепями в а-химотрипсине [1221]

образуют как бы два искаженных цилиндра (рис.15).

Цилиндр I включает остатки 29-112 и состоит из шести антипараллельных цепей. Цилиндр II образуется остатками 133-230 и также включает шесть антипараллельных отрезков полипептидной цепи. Четыре из пяти дисульфидных мостиков входят в состав этого цилиндра.

Боковые группы гидрофобных аминокислот ориентированы внутрь цилиндров, а гидрофильные, как правило, расположены на их поверхности. Оба цилиндра со прикасаются друг с другом, причем некоторые остатки гидрофобных аминокислот ориентированы в область контакта (Тгр29, 11е47, Тгр51, Val53, Phe89, ПеЮЗ, Leu105 и 11е212). С-концевая а-спираль также контактирует с обоими цилиндрами. В области контакта расположено около 10% молекул воды, связан-

2.5. Пространственная структура

77

них с белком. Примерно такое же количество молекул воды локализовано внутри глобулы. Остальные 80% связаны с поверхностью молекулы белка [12251-

Конформация основной цепи большинства остатков попадает в разрешенные области на диаграмме двугранных углов фиф [1221 ].

Следует отметить, что а-химотрипсин кристаллизуется в виде димера. Обе молекулы в димере практически одинаковы в отношении конформации основной цепи. Однако конформация боковых цепей, особенно в области межмолекулярных контактов, заметно отличается. То же справедливо при сравнении а-химотрип-сина с кристаллами мономерного 7-химотрипсина [1224,12261.

Эластаза и трипсин построены очень сходным образом. Оба эти фермента также состоят из двух доменов, тесно контактирующих один с другим. Так, в эластазе шесть N-концевых антипараллельных тяжей и шесть С-концевых тяжей образуют два цилиндра, внутренние полости которых, содержащие боковые цепи гидрофобных аминокислотных остатков, представляют собой "гидрофобные ядра" молекулы. Четыре дисульфидные связи эластазы участвуют в стабилизации структуры цилиндров и расположены в местах, эквивалентных положению соответствующих связей в химотрипсине и трипсине. К этим цилиндрам примыкает С-спиральный участок, который в эластазе образуют остатки 234-244 [12401.

Весьма сходными с этими тремя - ферментами являются структуры панкреатического калликреина А [12431, тонина [12441 и химазы II тучных клеток [12451- Основные различия здесь связаны с наружными петлеобразными структурами. Так, у калликреина структуры, окружающие субстратсвязывающий участок, более компактны, чем у трипсина. Аналогичные отличия наблюдаются и у тонина - фермента близкого калликреину. Имеются отличия и в структуре самих связывающих субстрат участков этих ферментов, отражающие различие в их специфичности (см. гл.6).

Две микробные протеазы - а-литическая и протеаза А из Streptomyces griseus - по своей первичной структуре, как было показано выше, довольно близки сериновым протеазам животных. Эта близость проявляется также и на уровне третичных структур [12971- Около 55% С^-атомов а-литической протеазы топологически эквивалентны соответствующим остаткам в эластазе [706]. Аналогично топологическая эквивалентность протеазы А и химотрипсина составляет 64%. Следует отметить, что гомология первичных структур эластазы и а-литической протеазы, а также протеазы А и химотрипсина существенно ниже и составляет соответственно 18 и 21%.

Оба микробных фермента очень близки в отношении пространственной структуры (рис.16). Соответственно и гомология первичных структур этих протеаз составляет 35%. Топологическая эквивалентность этих двух протеаз составляет 82%. Полипептидная цепь а-литической протеазы свернута так, что она образует два гидрофобных домена, каждый из которых включает четыре антипараллельные р-петли. Область контакта доменов заполнена боковыми цепями аминокислотных остатков и имеет довольно высокую электронную плотность. а-Спираль-ный участок протеазы включает лишь три витка (остатки 231-238). Интересно отметить, что один из остатков пролина (Рго99а) имеет цис-конфигурацию. Такое же положение наблюдается у соответствующего остатка в протеазах А и В Streptomyces griseus.

78 Глава вторая. Ферменты

РИС.16. Стереопара, иллюстрирующая сходство третичных структур а-литической протеазы (тонкая линия) и протеазы А из Streptomyces grfseus (жирная линия) [1257]

Значительно отличается от рассмотренных выше ферментов третичная структура субтилизинов BPN' и ВасШиз amylofaclens [1248-1250]. У субтилизина семь а-спиральных сегментов, включающих каждый по 7-10 аминокислотных остатков. Кроме того, имеются шесть параллельных р-слоев и два антипараллельных. Последние проходят через всю глобулу и составляют основу гидрофобного ядра молекулы. Довольно большое число гидрофобных остатков в субтилизинах контактирует с окружающим растворителем,

Несмотря на существенные отличия в строении субтилизинов от строения других изученных сериновых протеаз, области, важные для катализа у всех ферментов этой группы, строение которых известно, весьма сходны (см. разд.

2.6;). Структура сериновой D-аланилкарбокси-пептидазн существенно отличается от таковой для типичных сериновых протеаз [1260]. Этот фермент построен из а/р-кластера и нескольких р-складчатых тяжей. В области остатка Ser37 расположен субстратсвязываю-щий центр, так что Р-лактамное кольцо примыкает к гидроксильной группе серинового остатка.

Следует упомянуть также данные электронной микроскопии мультикаталитических протеиназ. Оказалось [1298,1299] (рис. 17), что эти ферменты образуют цилиндрический комп-

о о

леке диаметром 110 А и высотой 160 А, состоящий из четырех кольцевых образований.

а б

Рис.17. Схема строения мультикаталитических протеиназ а - по данным электронной микроскопии. Размеры: D=11 нм, Н=16 нм, d=4,3 нм; б - гипотетическая модель субъединичной организации [1298]

2.5. Пространственная структура

79

2.5.2. Цистеиновые аыидгидролазы

Из этой группы ферментов пространственная структура с достаточно высоким

о о

разрешением известна лишь для папаина (1,65 А) и актинидина (1,7 А). Оба фермента очень близки по своей пространственной организации. Оба они имеют четко выраженную двухдоменную структуру. У папаина домен L образуется остатками с 10 по 111 и с

страница 12
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

Скачать книгу "Химия протеолиза" (8.49Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
орматек подушка для детей
харсиев мусса адамович отзывы
урна уличная ул-10
спортивные аксессуары интернет магазин

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(27.06.2017)